小鼠甲狀腺素（T4）定量檢測試劑盒（ELISA）操作方法

實驗原理

本試劑盒采用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗小鼠甲狀腺素（T4）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入小鼠甲狀腺素（T4）校準品和待測樣本，再加入HRP標記的小鼠甲狀腺素（T4）抗原（酶標抗原），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉化為黃色，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度負相關。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度。

試劑盒限制性

1、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、 在試劑盒標示的有效期內使用，過期產品不得使用。

3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、 如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。

6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排出該因素。

7、 通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

技術提示

1、 混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、 加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、 合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、 使用自動洗板機時，加入一個30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。

5、 底物溶液為無色液體，保存過程中變為藍色，代表底物溶液已經失效，不得使用。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變為黃色。

7、 實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

8、 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒。

標準品濃度依次為：64、32、16、8、4、0 ng/mL.

其他用品

1、 酶標儀（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸頭

3、 蒸餾水

4、 洗瓶或者自動洗板機

5、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6、 500ml量筒

生物安全

1、 檢測必須符合實驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

2、 試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。

4、 戴上防護手套，實驗完成后洗手。

樣品的采集和儲存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、 細胞培養上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

2、 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復凍融。

3、 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。

樣本收集后，無法一次檢測完畢，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

4、 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。

5、 細胞提取液：貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。  

6、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

試劑準備

1、 使用前，所有的組分都要至少復溫60min，確保充分復溫到室溫。

2、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結晶產生，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內使用。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。

1、 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設置標準品孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。

3、除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL。

4、 用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、 揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。

6、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7、 所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結果計算

1、 以標準品濃度做為橫坐標，對應的吸光度（OD值）作為縱坐標，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線擬合（4-pl），創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

2、 如果樣品被稀釋，通過上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度。

試劑盒性能指標

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。

2、劑量反應曲線線性

校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。

4、靈敏度

小于0.1 ng/mL。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次在同一個板塊內回收率評估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組小鼠甲狀腺素（T4），與結構類似物無交叉。

7、穩定性

2℃-8℃保存，有效期6個月。

8、 檢測范圍

2 ng/mL - 64 ng/mL